Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific) – все для ПЦР

Applied Biosystems (ThermoFisher Scientific) – это реактивы, наборы и оборудование для ПЦР (классической, в режиме
реального времени, цифровой) и реактивы и оборудование для классического секвенирования по Сэнгеру.

1. Классическая ПЦР

• ферменты
• наборы и мастер-миксы
• амплификаторы классические

2. ПЦР в реальном времени

• мастер-миксы с SYBR Green
• все для метода TaqMan
• амплификаторы для ПЦР в реальном времени

3. Цифровая ПЦР
4. Секвенирование по Сэнгеру

• капиллярные секвенаторы
• реактивы и наборы
• реактивы и наборы для оценки чистоты препарата на фармпроизводстве (SEQ-методы)

5. ПО для анализа экспресси генов, генотипирования, дизайна праймеров

1. Классическая ПЦР

Applied Biosystems (ThermoFisher Scientific) предлагает полимеразы для решения любых экспериментальных задач, связанных с ПЦР. Высокие стандарты качества обеспечивают воспроизводимость результатов независимо от партии реактива.

• Стандартные рекомбинантные Taq-полимеразы для рутинной ПЦР с размером ампликонов до 5 т.п.н.

Серия AmpliTaq – обычная Taq-полимераза, AmpliTaq 360 – обладает улучшенной способностью амплифицировать GC-богатые последовательности.
Эти полимеразы также имеются в модификации Hot Start (AmpliTaq Gold, AmpliTaq Gold 360). Все эти полимеразы доступны в виде набора отдельных реагентов и в формате мастер-микс.

• Taq-полимеразы повышенной точности для получения ампликонов до 20 т.п.н.: Platinum, Platinum Pfx, AccuPrime и AccuPrime Pfx. Последовательности, полученные с помощью высокоточных полимераз, предназначены в первую очередь для клонирования. Полимеразы в модификации Pfx обладают максимальной безошибочностью синтеза (у полимеразы Pfx50 точность повышается в 50 раз относительно стандартной AmpliTaq), а серия AccuPrime характеризуется повышенной специфичностью. Все эти полимеразы предлагаются в виде набора отдельных реагентов, а полимеразы Platinum и AccuPrime Pfx доступны также в формате мастер-микс. Для экспериментов по подбору оптимальных условий амплификации предлагается набор, включающий в себя 4 варианта полимераз – Pfx50, AccuPrime Pfx и Platinum в виде отдельного фермента и в формате мастер-микс.

• Taq-полимеразы с высокой скоростью синтеза: GeneAmp и AmpliTaq в модификации Fast в формате мастер-микс. Время амплификации фрагментов до 500 п.н. снижается в 3-4 раза (с 2-2,5 часов до 30-40 минут). Мастер-микс GeneAmp Fast – для использования с амплификатором Veriti.

• Для получения длинных ампликонов, кроме описанных выше полимераз Platinum и AccuPrime, предлагаются наборы Elongase и SequiPrep Long PCR Kit. Набор Elongase представляет собой смесь полимераз для амплификации фрагментов до 30 т.п.н. Набор SequiPrep Long PCR Kit оптимизирован для GC-богатых последовательностей до 20 т.п.н. и предназначен, в первую очередь, для синтеза фрагментов ДНК с последующим секвенированием. Мастер-микс Platinum Multiplex – для мультиплексной ПЦР, включающей до 20 фрагментов длиной от 50 до 2500 п.н.

• Для амплификации GC-богатых и других сложных структур, кроме AmpliTaq 360, имеются полимеразы AccuPrime GC-rich и Platinum GenoType.

AccuPrime GC-rich – для амплификации GC-богатых последовательностей, а Platinum GenoType – для динуклеотидных повторов, которые часто приходится анализировать при генотипировании.

Классические амплификаторы

	Амплификатор SimpliAmp - простой в использовании, компактный и надёжный прибор, пришедший на замену модели GeneAmp 2720. Термоблок создан по технологии VeriFlex – из независимых элементов Пельтье. Другая особенность – цветной сенсорный экран. Данные, вводимые в амплификатор, можно сохранять с помощью сервиса Thermo Fisher Cloud
	Амплификатор ProFlex. Данная модель предлагается вместо GeneAmp 9700. Главная особенность ProFlex – наличие независимых термоблоков, что дает возможность одновременного проведения нескольких экспериментов с разными условиями. В стандартной комплектации – это 3 блока по 32 ячейки, но можно также установить два 96- или 384-луночных блока или специальный блок для работы с чипами OpenArray. Стоит отметить также дистанционное управление прибором с помощью мобильного устройства из любой удалённой точки.
	Амплификатор Veriti. Термоблок этого прибора создан по технологии VeriFlex и состоит из 6 независимых элементов Пельтье, что представляет собой альтернативу амплификации с градиентом температуры отжига. По сравнению с градиентной амплификацией, данный подход даёт возможность более точного выбора желаемой температуры отжига. Предлагается с 60-, 96-, или 384-луночными блоками.

2. ПЦР в реальном времени

Реактивы для ПЦР в реальном времени

Серия TaqMan. В данную серию входит более 8 миллионов наборов для анализа экспрессии генов, генотипирования точечных полиморфизмов (в том числе применительно к разным патологиям или особенностям метаболизма), анализа микроРНК и копийности генов методом ПЦР в режиме реального времени. Для анализа экспрессии генов 23 видов животных предлагается более 1.3 миллиона готовых наборов, предлагаемых в формате одиночных пробирок, 96-луночных плашек, 384-луночных чипов для микрофлюидики и чипов в формате OpenArray. Также в серии ТaqMan выпускаются мастер-миксы для работы с праймерами TaqMan. Кроме стандартных мастер-миксов для анализа экспрессии генов или генотипирования, предлагаются мастер микс TaqMan PreAmp для работы с малым количеством исходного материала (например, с одиночными клетками) или TaqMan Environmental для детекции патогенных микроорганизмов в образцах окружающей среды или пищевых продуктов, предназначенный для ПЦР в присутствии ингибиторов.

Мастер-миксы с интеркалирующим красителем SYBR Green для анализа экспрессии генов (например, Power SYBR Green и PowerUp SYBR Green) или для генотипирования по методике HRM (плавление с высоким разрешением). Важной особенностью этих мастер-миксов является то, что они совместимы с амплификаторами не только Applied Biosystems, но и других производителей – например, BioRad. Наборы и мастер-миксы для ОТ-ПЦР одношаговым методом выпускаются в различных вариациях. Наиболее универсальный – EXPRESS One-Step Superscript, включающий в себя обратную транскриптазу SuperScript III, рекомбинантный ингибитор РНКазы, Taq-полимеразу Platinum, а также термолабильную урацил-ДНК-гликозилазу (для снижения риска контаминации посторонними ДНК) и референсный краситель ROX в виде отдельного компонента или в составе смеси. Данный набор предназначен для анализа по технологии TaqMan, но имеются реагенты для работы с интеркалирующим красителем, например, RNA-to-Ct 1-Step Kit.

Амплификаторы для ПЦР в режиме реального времени

	Серия StepOne. Она даёт возможность амплификации 48 или 96 образцов с 3 или 5 типами флюоресцентных зондов и работу с программой HRM для генотипирования. Для амплификатора StepOne Plus предусмотрена возможность установки блока VeriFlex.
	Серия ViiA 7 предназначена для лабораторий с большим объёмом постановок ПЦР. По большому счёту, это один прибор с возможностью быстрой замены термоблоков – 96-луночных, 384-луночных и для чипов TaqMan. Он совместим с устройством для автоматической загрузки плашек в амплификатор Twister II Robot.
	Серия 7500 включает в себя 96-луночные амплификаторы для обычной ПЦР в режиме реального времени и для быстрой ПЦР (30 минут).
	Серия QuantStudio предназначена, в первую очередь, для использования с наборами TaqMan и пригодна для любых экспериментов, связанных с амплификацией в режиме реального времени. Модели QuantStudio 3 и QuantStudio 5 представляют собой бюджетные варианты Real-time амплификаторов и выпускаются только с предустановленными термоблоками, для остальные моделей предусматриваются сменные блоки различных форматов. Наиболее мощная модель в данной линейке – QuantStudio 12K. Эта модель может использоваться с блоком для слайдов OpenArray, позволяющим амплификацию 3072 образцов. Такой формат очень удобен для скрининга. Кроме того, ряд моделей предусматривает возможность работы с чипами TaqMan Array. Все модели предусматривают возможность мультиплексного анализа с разными флюоресцентными метками (от 4 до 6 светофильтров). Для исследователей, пользующихся моделями QuantStudio 3 и 5, предлагается облачный сервис Thermo Fisher Cloud для хранения данных размером 20 Гб, а для QuantStudio 12K Flex – 100 Гб.

3. Цифровая ПЦР

Цифровая ПЦР – новая технология, применяемая для детекции ДНК и её количественного анализа. Суть её в том, что исходный образец делится на множество микрореакций, и каждая из них происходит независимо. Идеальный вариант – когда в одну микрореакцию вступает не более одной молекулы ДНК. Для цифровой ПЦР Applied Biosystems предлагает систему QuantStudio 3D Digital PCR, а также все необходимые расходные материалы и реактивы - мастер-микс QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix и герметичные чипы для амплификации QuantStudio 3D Digital PCR Chip. Мастер микс предназначен для амплификации ДНК, выделенной из разных источников, или кДНК с помощью наборов TaqMan. В комплект QuantStudio 3D Digital PCR System Package входят амплификатор ProFlex 2 x Flat Block Thermal Cycler, устройство для подготовки чипов QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader, анализатор QuantStudiо 3D Digital PCR Instrument, а также чипы, мастер-микс, 2-летняя гарантия и однодневное обучение.

4. Секвенирование по Сэнгеру

Applied Biosystems предлагает капиллярные секвенаторы 3500 и 3730, а также их модификации 3500xL и 3730xL . Количество капилляров варьирует от 8 у 3500 до 96 у 3730xL - поэтому можно выбрать прибор в зависимости от объёмов исследований. Практически все модели секвенаторов пригодны для решения основных молекулярно-биологических задач, связанных с секвенированием – секвенирования клонов, содержащих генно-инженерные конструкции, секвенирования de novo, обнаружения полиморфизмов, секвенирования микросателлитной и митохондриальной ДНК, анализа метилирования и т.д. Кроме аппаратов, предлагается также весь спектр вспомогательных материалов – капилляры, полимерные наполнители капилляров, стандарты для секвенирования, растворы для приготовления проб и секвенирования.

Наборы, реактивы и методики для выявления контаминации

Под маркой SEQ предлагаются методы для выявления бактериальный и грибковой контаминации и других загрязнений, в первую очередь, для фармацевтических производств, а также для производства косметики, товаров для здоровья, исследовательских и медицинских лабораторий и т.д.

Под маркой MicroSeq предлагается продукция для выявления контаминации множеством видов бактерий и грибов. В основе метода для выявления контаминации конкретным видом – анализ гена 16S-РНК (в случае бактерий) или большой субъединицы рибосомы (для грибов). Анализ начинается с выделения ДНК из бактерий (колонии или культура) с помощью набора PrepMan и производится с помощью системы для анализа MicroSeq 3130 ID System, в которую включены амплификатор 9800 Fast Thermal Cycler и секвенатор 3130 Genetic Analyser. Для специфической амплификации видоспецифических генов предлагаются наборы серий MicrоSEQ 500 16S rDNA PCR и MicroSEQ Full Gene 16S rDNA PCR для анализа бактерий и MicroSEQ D2 Fungal rDNA для анализа грибов.
ПЦР-продукты очищаются с помощью наборов MicroSEQ ID Purification Combo и секвенируются с помощью наборов MicrоSEQ 500 16S rDNA Sequencing и MicroSEQ Full Gene 16S rDNA для анализа бактерий и MicroSEQ D2 Fungal rDNA для анализа грибов. Все эти наборы для амплификации также совместимы с 96-луночными амплификаторами серии Veriti.

Для более точных результатов рекомендуется использовать наборы для очистки анализируемых нуклеиновых кислот MicroSEQ ID Purification Combo Kit, включающие реагент для очистки продуктов амплификации ExoSAP-IT, а также плашки или картриджи MicroSEQ ID Sequencing Clean-up для дополнительной очистки секвенируемой ДНК после пробоподготовки.

Последний этап анализа – идентификация исследуемого организма. Для этого можно использовать программу MicroSEQ ID Microbial Identification, автоматически анализирующую данные, полученные на секвенаторах Applied Biosystems 3500, или самостоятельно идентифицировать последовательность с помощью библиотек данных MicroSEQ ID 16S rDNA 500 Library или MicroSEQ ID Fungal Gene Library.

5. Программное обеспечение

Программы для анализа экспрессии генов Самая простая бесплатная программа – DataAssist. Она использует метод ddCt (сравнительный пороговый метод) для быстрого определения относительного уровня экспрессии многих генов. Более продвинутая программа – ExpressionSuite. С её помощью можно анализировать данные на ПК или непосредственно на амплификаторах QuantStudio 6/7. Наибольшее количество возможностей даёт программа RealTime StatMiner. Она совместима с любыми данными, полученными с помощью ТaqMan или SYBR Green на различных платформах. Алгоритм анализа предусматривает различные способы оценки дифференциальной экспрессии генов. Наличие плагина TIBCO Sportfire дает возможность обработки больших массивов данных.

Программы для генотипирования

• Программа HRM – для анализа кривых плавления продуктов амплификации. Её можно установить на амплификаторы StepOnePlus, 7500 Fast, QuantStudio 3/5 или пользоваться через облачный сервис Thermo Fisher Cloud для онлайн-анализа.

• TaqMan Genotyper Software – для анализа результатов SNP-генотипирования, полученных с помощью методик TaqMan SNP (стандартных или рассчитанных по проекту исследователя) в формате плашек или чипов.

• Для анализа числа копий генов, исследуемого при помощи метода TaqMan Copy Number, служит программа CopyCaller. Данные, полученные при помощи TaqMan Genotyper и CopyCaller можно свести воедино с помощью программы AlleleTyper и получить информацию по гаплотипу.

• Программа TaqMan Mutation Detection даёт возможность определения типа мутации и частоты мутаций в анализируемых образцах.

Программа для дизайна праймеров

• Программа PrimerExpress предназначена для расчёта ПЦР-праймеров и зондов для анализа точечных полиморфизмов с использованием технологии TaqMan или с SYBR Green.

• Программы для белкового анализа: ProteinAssist – для расчёта относительного количества анализируемых белков, Protein Thermal Shift – для обработки данных экспериментов по плавлению белков, в частности, сравнению Т плавления, полученных разными методами, с контрольным образцом.